Оптика микроскопа (оптическая часть)
Оптические узлы и принадлежности обеспечивают основную функцию микроскопа — создание увеличенного изображения объекта с достаточной степенью достоверности по форме, соотношению размеров составляющих элементов и цвету. Кроме этого, оптика должна обеспечивать такое качество изображения, которое отвечает целям исследования и требованиям методик проводимого анализа.
Основными оптическими элементами микроскопа являются оптические элементы, образующие осветительную (в том числе, конденсор), наблюдательную (окуляры) и воспроизводящую (в том числе объективы) системы микроскопа.
Объективы микроскопа
Объективы микроскопа представляют собой оптические системы, предназначенные для построения микроскопического изображения в плоскости изображения с соответствующим увеличением, разрешением элементов, точностью воспроизведения по форме и цвету объекта исследования.
Они имеют сложную оптико-механическую конструкцию, которая включает несколько одиночных линз и компонентов, склеенных из 2-х или 3-х линз.
Количество линз обусловлено кругом решаемых объективом задач. Чем выше качество изображения, даваемое объективом, тем сложнее его оптическая схема. Общее число линз в сложном объективе может доходить до 14 (например, это может относиться к планапохроматическому объективу с увеличением 100х и числовой апертурой 1,40).
Объектив состоит из фронтальной и последующей частей. Фронтальная линза (или система линз) обращена к препарату и является основной при построении изображения соответствующего качества, определяет рабочее расстояние и числовую апертуру объектива. Последующая часть в сочетании с фронтальной обеспечивает требуемое увеличение, фокусное расстояние и качество изображения, а также определяет высоту объектива и длину тубуса микроскопа.
Числовая апертура и увеличение объективов
Чем больше NA (апертура) объектива, тем более мелкие детали он может разрешать. Если посмотреть на паспортные данные объективов, то можно видеть, что увеличение и апертура не связаны строго между собой. Так, например, существуют объективы 40/0,65; 40/1,3 и 100/1,3. Первые два дают изображения, сходные по размерам, однако второй позволяет различить более мелкие детали. Два последних объектива, масляно-иммерсионные, имеют одинаковое разрешение, но объектив 40 позволяет наблюдать большую площадь препарата (при меньшем увеличении) по сравнению с объективом 100.
Объективы следует выбирать, исходя, главным образом, из их апертуры, а следовательно, из разрешающей способности, а не из увеличения. В настоящее время многие микроскопы снабжены системами переменного увеличения, которые позволяют изменять конечное увеличение приблизительно вдвое. Кроме того, при печати можно давать дополнительное фотоувеличение. Из трех упомянутых выше объективов при прочих равных характеристиках рекомендуется для получения качественных фотомикрографий объектив 40/1,3.
Исправление аберраций
Объективы для микроскопов подразделяются на несколько типов в зависимости от степени исправления хроматической и сферической аберраций. Эти типы можно в свою очередь подразделить в соответствии с тем, насколько объективы свободны от кривизны поля зрения, каковы их увеличение и числовая апертура, являются ли они сухими или иммерсионными.
Простейшие объективы — это ахроматы, которые сводят синие и красные лучи в один фокус, несколько отличающийся от фокуса для зеленого света. Даваемое ими изображение может иметь слабо заметные цветные кольца, окрашенные в зависимости от фокусировки в зеленый или пурпурный цвет. Ахроматы исправлены в отношении сферической аберрации только для зеленых лучей. Они сравнительно дешевы и пригодны для визуальных наблюдений. Для фотомикрографии их следует использовать по возможности вместе с
монохроматическим зеленым светофильтром или интерференционным
зеленым фильтром. Тогда они дают сравнительно хорошие результаты.
Флюоритовые объективы (названные так потому, что в них стоят линзы из минерала флюорита), или полуапохроматы, лучше исправлены в отношении хроматической аберрации, чем ахроматы. Благодаря этому они выпускаются с относительно большей (при данном увеличении) апертурой и дают более качественное и контрастное изображение. Простота конструкции и большая светосила делают флюоритовые объективы удобными для флуоресцентной микроскопии. Они также могут быть с успехом использованы для фотомикрографии.
Апохроматы представляют собой наиболее скорректированные объективы, у которых практически
полностью исправлена хроматическая аберрация, а сферическая аберрация исправлена не для одного, а для двух цветов. Эти объективы дают высококачественное изображение и более всего подходят для качественной фотомикрографии, особенно в цвете. Такие объективы сложны в изготовлении, поэтому в микроскопах многих фирм добиваются коррекции вторичной хроматической аберрации с помощью специальных «компенсационных» окуляров. По этой причине полностью исправленная система состоит из объектива и соответствующего окуляра. Для объективов, изготовленных различными фирмами, а иногда и для разных объективов, выпускаемых одной фирмой, нужны различные окуляры. В некоторых случаях полная коррекция аберраций проведена в самом объективе. Обычно практикуемая в лабораториях беспорядочная замена оптических элементов, очевидно, не может дать хороших результатов. Если нет уверенности в целесообразности той или иной замены, то следует обратиться к инструкциям изготовителя.
Сухие объективы и толщина покровного стекла
Если использовать объектив не так, как рекомендуется, то качество изображения ухудшится из-за неполной коррекции сферической аберрации. Для большинства сухих объективов (то есть рассчитанных на воздушную прослойку между препаратом и фронтальной линзой) требуется покровное стекло толщиной 0,17 мм, и последнее число выгравировано на их оправе. Некоторые объективы, маркированные Эпи (Epi), 0, или просто «—», рассчитаны на работу с непокрытым препаратом, другие, наоборот, могут быть использованы при работе с культуральными флаконами и рассчитаны на толщину их стенок до 2 мм.
Небольшие отклонения в толщине покровного стекла, как правило, несущественны для объективов с апертурой менее 0,65, но имеют значение для сухих объективов с большой апертурой (0,75—0,95). Эти объективы часто имеют коррекционную оправу, которая позволяет добиваться максимальной коррекции сферической аберрации за счет изменения расстояния между линзами объектива. Даже при использовании покровного стекла нужной толщины может потребоваться коррекция на дополнительную толщину, создаваемую заливочной средой.
Иммерсионные объективы
Иммерсия (от лат. immersio — погружение) — жидкость, заполняющая пространство между объектом наблюдения и специальным иммерсионным объективом (конденсором и предметным стеклом).
Иммерсионные объективы необходимо использовать в тех случаях, когда нужна апертура 1,0 и более. Иммерсионная жидкость, расположенная между объектом и фронтальным компонентом объектива, увеличивает угол, под которым рассматривается объект (апертурный угол).
Большинство иммерсионных объективов рассчитаны на работу со специально изготовленным маслом. Кроме того, имеются объективы для работы с водной и с глицериновой иммерсией, а также объективы, настраиваемые для работы с любой иммерсионной средой. Поскольку оптические свойства заливочной среды, покровного стекла и иммерсионного масла близки, то большая или меньшая толщина одного слоя по сравнению с другим не приводит к искажениям. Поэтому при фотомикрографии значительно лучше использовать иммерсионный объектив 40/1,0. а не сухой 40/0,95.
Другими словами, особенности использования иммерсионных объективов таковы:
1. повышение видимости за счет увеличения разности показателя преломления среды и объекта;
2. увеличение глубины просматриваемого слоя, который зависит от показателя преломления среды.
Кроме того, иммерсионная жидкость может уменьшать количество рассеянного света за счет исчезновения бликов от объекта. При этом устраняются неизбежные потери света при его попадании в объектив.
Поскольку иммерсионные масла несколько различаются, то при их применении следует руководствоваться рекомендациями фирмы-изготовителя оптики. Особенно важно избегать смешения различных масел. Если на объективе остались следы масла, то при использовании другого масла качество изображения может ухудшиться, поэтому объективы необходимо чистить.
Глубина резкости
Многие объективы дают изображение, в котором центральная часть и периферия не могут быть сфокусированы одновременно. Чтобы решить данную проблему, фирмы-изготовители выпускают специальные объективы с минимальной
кривизной поля зрения, которые отмечены приставкой «План» (Plan), например Планахромат и Планапохромат, где исправлена кривизна изображения по полю, что обеспечивает резкое изображение объекта по всему полю наблюдения.
По параметрическим признакам объективы делятся следующим образом:
• объективы с конечной длиной тубуса (например, 160 мм) и объективы, скорректированные на длину тубуса «бесконечность» (например, с дополнительной тубусной системой, имеющей фокусное расстояние 160 мм);
• объективы малых (до 10х); средних (до 50х) и больших (более 50х) увеличений, а также объективы со сверхбольшим увеличением (свыше 100 х);
• объективы малых (до 0,25), средних (до 0,65) и больших (более 0,65) числовых апертур, а также объективы с увеличенными (по сравнению с обычными) числовыми апертурами (например, объективы апохроматической коррекции, а также специальные объективы для люминесцентных микроскопов);
• объективы с увеличенными (по сравнению с обычными) рабочими расстояниями, а также с большими и сверхбольшими рабочими расстояниями (объективы для работы в инвертированных микроскопах). Рабочее расстояние — это свободное расстояние между объектом (плоскостью покровного стекла) и нижним краем оправы (линзы, если она выступает) фронтального компонента объектива;
• объективы, обеспечивающие наблюдение в пределах нормального линейного поля (до 18 мм); широкопольные объективы (до 22,5 мм); сверхширокопольные объективы (более 22,5 мм);
• объективы стандартные (45 мм, 33 мм) и нестандартные по высоте. Высота — расстояние от опорной плоскости объектива (плоскости соприкосновения ввинченного объектива с револьверным устройством) до плоскости предмета при сфокусированном микроскопе, является постоянной величиной и обеспечивает парфокальность комплекта аналогичных по высоте объективов разного увеличения, установленных в револьверном устройстве. Иными словами, если с помощью объектива одного увеличения получить резкое изображение объекта, то при переходе к последующим увеличениям изображение объекта остается резким в пределах глубины резкости объектива.
По конструктивно-технологическим признакам существует следующее разделение:
• объективы, имеющие пружинящую оправу (начиная с числовой апертуры 0,50), и без нее;
• объективы, имеющие ирисовую диафрагму внутри для изменения числовой апертуры (например, в объективах с увеличенной числовой апертурой, в объективах проходящего света для реализации метода темного поля, в поляризационных объективах отраженного света);
• объективы с корректирующей (управляющей) оправой, которая обеспечивает движение оптических элементов внутри объектива (например, для корректировки качества изображения объектива при работе с различной толщиной покровного стекла или с различными иммерсионными жидкостями; а также для изменения увеличения при плавной — панкратической — смене увеличения) и без нее.
По обеспечению методов исследования и контрастирования объективы можно разделить следующим образом:
• объективы, работающие с покровным и без покровного стекла;
• объективы проходящего и отраженного света (безрефлексные); люминесцентные объективы (с минимумом собственной люминесценции); поляризационные объективы (без натяжения стекла в оптических элементах, т. е. не вносящие собственную деполяризацию); фазовые объективы (имеющие фазовый элемент — полупрозрачное кольцо внутри объектива); объективы ДИК (DIC), работающие по методу дифференциально-интерференционного контраста (поляризационные с призменным элементом); эпиобъективы (объективы отраженного света, предназначенные для обеспечения методов светлого и темного поля, имеют в конструкции специально рассчитанные осветительные эпи-зеркала);
• иммерсионные и безыммерсионные объективы.
Маркировка объективов.
Данные о каждом объективе маркируются на его корпусе с указанием следующих параметров:
• увеличение («х»-крат, раз): 8х, 40х, 90х;
• числовая апертура: 0,20; 0,65,
• пример: 40/0,65 или 40х/0,65;
• дополнительная буквенная маркировка, если объектив используется при различных методах исследования и контрастирования: фазовый — Ф (Рп2 — цифра соответствует маркировке на специальном конденсоре или вкладыше), поляризационный — П (Pol), люминесцентный — Л (L), фазово-люминесцентный — ФЛ (PhL), ЭПИ (Epi, HD) — эпиобъектив для работы в отраженном свете по методу темного поля, дифференциально-интерференционный контраст — ДИК (DIC), пример: 40х/0,65 Ф или Ph2 40x/0,65;
• маркировка типа оптической коррекции: апохромат — АПО (АРО), планахромат — ПЛАН (PL, Plan), планапохромат — ПЛАН-АПО (Plan-Аро), улучшенный ахромат, полуплан — СХ — стигмахромат (Achrostigmat, CP-achromat, Achroplan), микрофлюар (полуплан-полуапохромат) — СФ или М-ФЛЮАР (MICROFLUAR, NEOFLUAR, NPL, FLUOTAR).
Окуляры микроскопа
Оптические системы, предназначенные для построения микроскопического изображения на сетчатке глаза наблюдателя. В общем виде окуляры состоят из двух групп линз: глазной — ближайшей к глазу наблюдателя — и полевой — ближайшей к плоскости, в которой объектив строит изображение рассматриваемого объекта.
Окуляры классифицируются по тем же группам признаков, что и объективы:
1. окуляры компенсационного (К — компенсируют хроматическую разность увеличения объективов свыше 0,8%) и безкомпенсационного действия;
2. окуляры обычные и плоского поля;
3. окуляры широкоугольные (с окулярным числом — произведение увеличения окуляра на его линейное поле — более 180); сверхширокоугольные (с окулярным числом более 225);
4. окуляры с вынесенным зрачком для работы в очках и без;
5. окуляры для наблюдения, проекционные, фотоокуляры, гамалы;
6. окуляры с внутренней наводкой (с помощью подвижного элемента внутри окуляра происходит настройка на резкое изображение сетки или плоскость изображения микроскопа; а также плавное, панкратическое изменение увеличения окуляра) и без нее.
Маркировка окуляров.
На окулярах маркируют следующие характеристики:
• линейное увеличение окуляра: 10х, 15х
• линейное поле зрения (в мм): 18, 20, 22
• пример: 10х/18
• работа в очках (дополнительный символ в виде очков);
• фокусировочный (передвижной) элемент внутри окуляра для наводки на резкость изображения сетки окуляра (foc.)
• тип коррекции (Pl) или компенсация хроматической разности увеличения (К)
Источник
