Что значит ингибирование вируса

Что значит ингибирование вируса

Вирусные инфекции могут поражать любой орган человека. Большинство вирусных инфекций протекает бессимптомно, но если инфекция носит симптоматический характер, ее тяжесть варьирует в широких пределах: от кратковременного заболевания, такого как насморк, до продолжительной, потенциально фатальной инфекции, например вызываемой вирусом иммунодефицита человека (ВИЧ) типа 1.
Вирусы можно избирательно ингибировать с помощью лекарств.

Избирательной ингибиции вирусов можно добиться двумя способами:
• ингибицией таких уникальных этапов репликации вируса, как связывание вируса с клеточными рецепторами, пенетрация, декапсидация, сборка или высвобождение вируса;
• преимущественной ингибицией этапов, свойственных также клеткам организма-хозяина, включая транскрипцию и трансляцию.

Потенциальную терапевтическую эффективность антивирусного препарата можно оценить in vitro, однако прогностическое значение этих данных существенно ниже, чем в случае определения in vitro лекарственной чувствительности бактерий. Отсутствие стандартизированных методов тестирования in vitro и недостаточное знание фармакокинетических и фармакодинамических отношений затрудняют точное определение соотношения между концентрацией лекарства и антивирусным эффектом.

Развитие резистентности вирусов часто ограничивает применимость антивирусных препаратов. Считается, что возникновение резистентности в процессе лечения наблюдается при использовании всех современных антивирусных препаратов, за исключением рибавирина, трифтортимидина, цидофовира и соривудина. Резистентность возникает в результате мутаций нуклеотидов, однако такие вирусы все еще могут оставаться чувствительными к другим антивирусным веществам, обладающим иным механизмом действия. Появление резистентных штаммов можно свести к минимуму, применяя комбинацию многих лекарственных веществ, как это принято при лечении инфекции, вызываемой ВИЧ-1.
Успех антивирусной химиотерапии зависит от иммунокомпетентности организма. Существующие в настоящее время антивирусные препараты обладают лишь вирусостатическим действием.

Симптомы и признаки вирусной инфекции обусловлены характером ответа организма. Ответ организма-хозяина на вирусную инфекцию варьирует от острого воспаления (например, менингоэнцефалит) до гипертрофии и гиперплазии (бородавки) или онкогенеза (например, Т-клеточный лейкоз, вызываемый лимфотропным вирусом 1 человека).

Воспалительный ответ клеток обычно ингибирует репликацию вируса и приводит к выздоровлению. У пациентов с нарушением иммунного ответа вирусная инфекция может носить затяжной характер и иметь более тяжелое течение. Иногда сам иммунный ответ организма вызывает патологические явления (например, при геморрагической лихорадке Денге). В редких случаях репликация вируса вызывает лишь слабую воспалительную реакцию или реакция отсутствует полностью, но тем не менее инфекция оказывается летальной (например, бешенство).

Антивирусные препараты эффективны против некоторых часто встречающихся вирусных инфекций. Антивирусные препараты дают терапевтический эффект при инфекциях, вызываемых следующими вирусами:
• вирусы герпеса (HSV-1, HSV-2, HHV-8, VZV и CMV);
• вирус гриппа А и В;
• респираторный синцитиальный вирус (RSV);

• вирусы гепатита В и С (HBV и HCV);
• вирусы папилломы человека (HPV);
• аренавирус лихорадки Ласса;
• вирус иммунодефицита человека (ВИЧ-1, ВИЧ-2).

Источник

Воздействие на клеточные мишени как средство борьбы с гриппозной инфекцией

В.В. Зарубаев 1 , В.С. Смирнов 2

1 ФГБУ НИИ гриппа МЗ РФ, Санкт-Петербург, Россия

2 ЗАО МБНПК«Цитомед», Санкт-Петербург, Россия

Скачать PDF

Резюме. Грипп представляет собой высоко контагиозное заболевание человека. На фоне использования про­тивовирусных препаратов формируются лекарственно-устойчивые штаммы вируса, следствием чего являет­ся снижение эффективности этиотропной химиотерапии. В обзоре рассмотрены способы снижения уровня репликации вируса и тяжести патологического процесса, основанные на использовании альтернативных мишеней не вирусного, а клеточного происхождения. Описаны препараты, снижающие продукцию провос­палительных цитокинов (эриторан), ограничивающие дегрануляцию тучных клеток (кетотифен), ингибито­ры циклооксигеназ (целекоксиб, месалазин, SC-560), ингибиторы сфингозин-1-фосфатного пути (AAL-R), а также повышающие стабильность сосудов путем упрочения контактов между эндотелиальными клетками (белок Slit). Особое внимание уделено ингибиторам клеточных путей, используемых вирусом для повышения репродукции, таких как NF-kB, Raf/MEK/ERK, PI3K/AKT/mTOR. Описана противогриппозная активность ингибиторов киназ и процесса аутофагии, а также препаратов смешанного механизма действия — глицирри- зиновой кислоты и дипептида а-глутамилтриптофана. Дальнейшие исследования в области поиска и опти­мизации ингибиторов клеточных компонентов как средств против гриппозной инфекции могут привести к разработке новых противовирусных препаратов высокой эффективности, широкого спектра действия и низкой вероятности развития резистентности.

Грипп представляет собой высококонтагиоз­ное заболевание человека. Ежегодно гриппом на планете переболевает 500 млн человек, уми­рает около 2 млн [23]. Вирус гриппа вызывает ежегодные эпидемии, а при появлении нового антигенного варианта вируса — пандемии, охва­тывающие все регионы земного шара и характе­ризующиеся высокой заболеваемостью, числом пациентов, нуждающихся в госпитализации и смертностью среди всех возрастных групп на­селения. Пандемия гриппа А(H1N1)pdm09 ха­рактеризовалась широким охватом населения многих стран мира, в том числе Российской Фе­дерации, тяжелым клиническим течением и вы­сокой летальностью [5, 16]. Неблагоприятные исходы чаще всего наблюдались не только у лиц с сопутствующими хроническими заболевания­ми [16], но и у молодых людей без существенной предшествующей патологии, в том числе у бе­ременных женщин [3, 4]. В последние годы от­мечены также случаи инфицирования человека вирусами гриппа птичьего происхождения под­типов H5N1, H7N7 и H7N9 [39].

Вирионы гриппа представляют собой сфе­рические или нитевидные частицы диаметром 80—100 нм, покрытые липидной оболочкой с ин­тегрированными поверхностными гликопро­теидами трех типов — гемагглютинином (HA) и нейраминидазой (NA) и вирусным ионным каналом М2. Оболочка вириона происходит от плазматической мембраны клетки-хозяина и содержит липидные «плотики» — участки ли­пидного бислоя, обогащенные холестерином и имеющие высокую плотность и меньшую те­кучесть, отделенные друг от друга текучими участками мембраны малой плотности. Под ли­пидной оболочкой расположен слой матриксно­го белка M1, контактирующего с одной стороны с цитоплазматическими доменами HA и NA, а с другой — с сердцевиной вириона. Сердце­винный рибонуклеопротеин (РНП) представлен восемью сегментами генома — одноцепочечной РНК негативной полярности — в комплексе с белком нуклеопротеина и тремя субъединица­ми полимеразного комплекса.

При инфицировании клетки РНП попада­ют в цитоплазму и ядро, где происходит транс­крипция, трансляция и репликация сегментов вирусного генома. Транскрипция и репликация вирусспецифических РНК осуществляются ви­русным полимеразным комплексом. В отличие от полимераз эукариотических клеток, вирусная полимераза лишена механизма коррекции оши­бок. Вследствие этого частота мутаций вирусно­го генома составляет, по разным оценкам, от 10 -4 до 10 -6 нуклеотидов на цикл репликации [44, 54]. Это на несколько порядков выше, чем скорость мутирования бактерий и эукариот (10 -10 —10 -11 ) [10]. Вследствие этих особенностей, а также ко­роткого жизненного цикла эволюция вируса гриппа протекает быстро. Это служит причи­ной двух явлений. Во-первых, быстрое фор­мирование мутаций позволяет вирусу ускольз­ать от адаптивного иммунного ответа хозяина. Благодаря этому он способен вызывать ежегод­ные эпидемии, несмотря на формирование им­мунной прослойки населения как следствие вакцинации и естественной заболеваемости. Во-вторых, на фоне использования противови­русных препаратов формируются лекарственно­устойчивые штаммы вируса, следствием чего является снижение эффективности противовирусной химиотерапии.

В настоящее время для профилактики и те­рапии гриппозной инфекции доступны пре­параты, обладающие различным механизмом активности. Следуя последовательности собы­тий при развитии гриппозной инфекции, к ним необходимо отнести, во-первых, препараты ин- терферонов и их индукторов, стимулирующие врожденный иммунитет и ограничивающие инфекцию на ранних стадиях [55], и во-вто­рых, этиотропные препараты, воздействующие на специфические вирусные мишени. Между­народно признанными противогриппозными препаратами являются химические соедине­ния двух групп — производные адамантана (амантадин и его аналог в России — реманта­дин) [49] и ингибиторы вирусной нейрамини- дазы — осельтамивир (Тамифлю®) и занамивир (Реленца®) [8]. В США получено разрешение FDA на использование еще двух ингибиторов нейраминидазы — перамивира (Рапиакта®) внутривенно [50], и ланинамивира (Инавир®) ингаляционно [58]. В России ни перамивир, ни ланинамивир не сертифицированы. Смотрите также публикацию: о роли иммуномодуляторов в лечении и профилактике ГРИППА и ОРВИ.

Недостатком препаратов как первой, так и второй группы является снижение их эф­фективности при позднем начале лечения [29]. Препараты интерферонов и их индукторов про­являют максимальный уровень защиты при использовании в качестве средств экстренной профилактики, проводимой сразу после инфицирования, еще до появления клинических симптомов. Этиотропные средства эффектив­ны в первые 48 ч после появления клинических симптомов болезни [29]. Кроме того, к этиотроп­ным препаратам вирус, как уже упоминалось, способен быстро вырабатывать устойчивость. С середины 90-х гг., например, отмечен рост доли ремантадин-устойчивых вирусов, и на сегод­няшний день практически все изоляты вируса гриппа устойчивы к препаратам адамантаново- го ряда — амантадину и ремантадину [19]. То же было отмечено в пределах подтипа сезонного гриппа A(H1N1), когда за полтора года (с ноя­бря 2007 по март 2009 г.) уровень устойчивости к осельтамивиру вырос с 0 до 100% во всех регио­нах земного шара [9]. Осельтамивир-устойчивые штаммы отмечены также среди изолятов высо­копатогенных вирусов гриппа птиц H5N1 [19] и H7N9 [22], а кроме того, описаны случаи фор­мирования лекарственно-устойчивых вариан­тов вируса непосредственно в процессе терапии пациентов [22].

Когда речь идет о случаях тяжелого, затяжно­го, осложненного гриппа, включающих послед­ствия цитокинового шторма [56], или поздних стадий болезни, для уменьшения тяжести забо­левания применяют препараты третьей группы, снижающие остроту реактивных процессов. Та­кие процессы индуцируются вирусом, но реа­лизуются механизмами хозяина. К ним следует отнести такие явления, как отек легких, токси­ческий синдром, гиперпродукцию провоспали­тельных цитокинов, клеточную воспалительную инфильтрацию ткани легких, геморрагический синдром и т.п. Препараты этой группы не влия­ют на вирусную репродукцию, а представляют собой средства, влияющие на другие факторы патогенеза гриппозной инфекции, то есть сред­ства патогенетической терапии.

Эти соединения являются важной состав­ляющей терапии не только гриппа, но и других заболеваний со сходным патогенезом. Так, на­пример, в качестве средства борьбы с экспресси­ей провоспалительных цитокинов при сепсисе был разработан антагонист TLR4 эриторан [42]. Помимо сепсиса, однако, он оказался эффектив­ным средством защиты и от летальной гриппоз­ной инфекции [52]. При дозе вируса, вызываю­щей гибель 90% животных в контроле, в группе, получавшей эриторан со 2 суток после инфици­рования, гибель составила лишь 10—20%, что обеспечивало индекс защшы 78—89%, сопоста­вимый с показателями препарата сравнения — этиотропного средства осельтамивира. Более того, эриторан проявлял протективную актив­ность и на поздних стадиях инфекции, вплоть до 6-х суток после заражения, когда активность осельтамивира уже не отмечалась [52]. Использо­вание эриторана приводило также к значитель­ной нормализации морфологической картины легких, снижая степень отека и воспалитель­ной инфильтрации легочной ткани. При этом инфекционная активность вируса не менялась под воздействием препарата за исключением поздних стадий развития инфекции, когда раз­множение вируса в ткани уже не играет ведущей патогенетической роли.

Тяжесть гриппа, как уже упоминалось, во мно­гом обусловлена дисрегуляцией воспалительного ответа на заражение вирусом. Такая инфекция характеризуется избыточной степенью воспали­тельных процессов и гиперпродукцией провос­палительных цитокинов, известной как «цито- киновый шторм» [56]. Одним из ведущих путей развития воспаления является каскад реакций, запускаемый ферментами циклооксигеназами COX-1 и COX-2, катализирующими превращение арахидоновой кислоты в простагландины. Инги­биторы циклооксигеназ широко используются в медицине как анальгетики и противовоспали­тельные средства. Классические нестероидные противовоспалительные препараты блокируют как COX-1, так и COX-2, предпочтительнее все же COX-1. В эксперименте синтетические ин­гибиторы COX-2 (целекоксиб) и COX-1 (SC-560) оказались способны в значительной мере сни­зить продукцию провоспалительных цитокинов TNFa и G-CSF в бронхолегочных смывах мышей при гриппозной инфекции [6], однако сколько- нибудь существенного влияния на смертность животных, а тем более на продукцию вируса в легких обнаружено не было. Больше того, из­бирательное угнетение COX-1 приводило даже к повышению смертности, потере веса животны­ми и более выраженной гипотермии, возможно играющей в данном случае ключевую роль.

В другом исследовании [62] была показана дополнительная протективная активность ком­бинации двух ингибиторов оксигеназ — целе- коксиба и месалазина — с противогриппозным препаратом прямого действия занамивиром. Целекоксиб, как уже указывалось, ингибирует фермент COX-2, месалазин способен угнетать как циклооксигеназный, так и липоксигеназ- ный воспалительные пути, приводя к сниже­нию продукции провоспалительных цитокинов и эйкозаноидов, и, как следствие, к деактивации воспалительных клеток, таких как макрофаги и нейтрофилы. Кроме того, месалазин ингиби­рует активацию фактора NF-kB и стимулирует синтез фосфатидной кислоты, угнетая тем са­мым стимуляцию апоптоза церамидами [62]. При начале лечения через 48 часов после инфи­цирования, что моделирует реальную ситуацию в клинической практике, смертность в группе животных, получавших комбинированное ле­чение, была ниже, чем в группе, получавшей за- намивир в виде монопрепарата. Снижение титра вируса в легких при этом сопровождалось нор­мализацией структуры легочной ткани и сниже­нием степени ее воспалительной инфильтрации, в отличие от группы занамивира, где на фоне снижения инфекционной активности вируса не отмечалось разницы в смертности животных и воспалительной реакции в легких.

Другой противовоспалительный препарат — кетотифен — ингибирует процессы деграну­ляции тучных клеток [26]. Этим достигается ограничение продукции в очаге воспаления про­воспалительных медиаторов, включая гистамин, IFNy и фермент триптазу. Эти свойства кетоти- фена обуславливают его высокую протективную активность на модели летальной гриппозной ин­фекции, вызванной высокопатогенным вирусом гриппа подтипа H5N1 [24]. Не влияя собственно на репродукцию вируса в легких, кетотифен, тем не менее, нормализовал показатели веса живот­ных, снижал степень отека и воспалительной инфильтрации легочной ткани, уровень апопто- тических процессов в легких и специфическую смертность животных. При этом активность кетотифена, как и в случае эриторана, превыша­ла активность вирусспецифического препарата осельтамивира [24].

Таким образом, приведенные данные свиде­тельствуют, что необходимы дополнительные экспериментальные и/или клинические иссле­дования, чтобы достоверно обосновать и стан­дартизировать применение ингибиторов цикло­оксигеназ в терапии тяжелого гриппа [25].

Важную роль в развитии воспаления в ор­ганизме играет система реакций сфингозин- 1-фосфатного пути (S1P). Компоненты этого каскада играют важную роль в самых разных аспектах клеточного сигналинга и метаболиз­ма. О важности этого пути свидетельствует, на­пример, тот факт, что стимуляция синтеза S1P приводит к активации факторов транскрипции NF-kB и STAT3 с последующим формировани­ем сигнальной петли, ведущей к злокачестве- ному перерождению клетки. Ингибирование этого процесса фармакологическими препара­тами замедляет рост и прогрессирование опу­холи и уровень воспалительных медиаторов. На 2013 г. описано свыше 25 препаратов, влия­ющих на компоненты S1 P-сигнального пути, из них 11 находятся на завершающих стадиях клинических испытаний или разрешены к при­менению как средства терапии опухолей, рев­матоидного артрита, язвенного колита, рассе­янного склероза, псориаза, то есть патологий, так или иначе основанных на избыточном или неадекватном воспалении [31]. Рецепторы S1P (S1PR1—S1PR5) участвуют в развитии сепсиса, изменении проницаемости сосудов и развитии отека легких. При этом именно последнее ка­сается темы настоящего обзора и обосновывает правомочность регуляции этих компонентов при тяжелом гриппе, признаком которого явля­ется как раз отек легких.

Действительно, применение агониста S1P AAL-R (рис. 1), направленного против раннего иммунного ответа, приводило к существенному снижению смертности животных в эксперимен­те [59], причем степень защиты (82%) превосхо­дила соответствующий показатель для препара­та сравнения — осельтамивира (50%).

Рисунок 1. Структура агониста сфингозин-1- фосфатного пути AAL-R

Подобно кетотифену, AAL-R не влиял на ре­продукцию вируса в легких животных, однако в значительной степени снижал количество кле­ток, составляющих воспалительный экссудат. Способность к продукции противовирусных антител при этом сохранялась. Оптимальные защитные показатели были достигнуты при со­вместном применении осельтамивира и AAL-R. Важно также, что использование этого сфин- гозинового аналога оказалось эффективным даже спустя 4 суток после начала инфекции, что свидетельствует о высоком терапевтическом по­тенциале такого подхода при терапии поздних и осложненных форм гриппа [36].

Отдельного внимания заслуживает еще один подход к терапии тяжелого гриппа — повыше­ние способности организма к преодолению па­тологического процесса путем минимизации вредного действия воспалительных медиаторов на сосуды. Известно, что характерным свойством гриппа является резкое повышение проницае­мости гистогематического барьера, что ведет к развитию множественных геморрагий и обу­словливает полиорганную недостаточность при тяжелом гриппе [28]. Для компенсации этой по­вышенной проницаемости сосудов в организме существуют сигнальные пути противоположной направленности, стабилизирующие состояние эндотелия и базальных мембран. Так, например, последовательность реакций, запускаемая бел­ком Slit и опосредуемая эндотелиальным рецеп­тором Robo4, была идентифицирована как путь, модулирующий стабильность сосудов путем упрочения контактов между эндотелиальны­ми клетками. Активация такого пути оказалась эффективной для снижения проницаемости ка­пилляров, мультиорганного отека и смертности при многих формах экспериментальных инфек­ций, включая высокопатогенный грипп H5N1 [32]. При этом сам белок Slit не влиял на продук­цию вируса. Более того, что особенно важно, он не оказывал воздействия даже на уровень про­воспалительных цитокинов в легких, что сви­детельствует о том, что самого по себе ограни­чения реакции сосудов на гиперцитокинемию достаточно для снижения тяжести заболевания и уровня смертности. В описанных опытах, на­пример, было достигнуто снижение смертности на 40—50%.

В целом, перечисленные препараты приме­няются как патогенетические средства для те­рапии тяжелого гриппа. Отличительная их осо­бенность — высокий терапевтический эффект на поздних сроках заболевания и в случаях тяже­лого и осложненного гриппа — основана на кон­кретных мишенях их действия и особенностях патогенеза таких форм инфекции. Известно, что с точки зрения патогенеза любой инфекци­онный процесс является суммой действия соб­ственно патогена и ответной реакции организма. Как уже упоминалось, препараты прямого про­тивовирусного действия активны лишь в первые дни заболевания, когда в организме протекают интенсивные процессы вирусной репродукции. Однако при уже запущенных реактивных про­цессах — цитокиновом шторме и массовой де­струкции клеток, сформированном отеке легких и нарушениях микроциркуляции органов — основной вклад в патогенез гриппа вносит уже не вирусный, а именно реактивный компонент. Поэтому естественно, что препараты, направ­ленные против этих факторов патогенеза имеют терапевтическую активность.

Выделяется, однако, еще одна, четвертая группа химических препаратов, которая заслу­живает отдельного упоминания. Так же, как и препараты предыдущей группы, эти соеди­нения воздействуют не на вирусные, а на кле­точные мишени. Особенность этих мишеней состоит в том, что выполняя функции, важные для клетки, они являются необходимыми для жизненного цикла самого вируса. Емкость ви­русного генома очень ограничена, и в ходе ре­продукции он вынужден использовать многие клеточные компоненты, в том числе метаболиче­ские и сигнальные механизмы клетки-хозяина. Естественно, что их ингибирование снижает инфекционную активность вируса и уровень его репликации.

Чтобы пояснить зависимость вирусной ре­продукции от клеточных метаболических путей, приведем наиболее очевидный пример — транс­ляция вирусных мРНК, полностью обеспечи­ваемая клеточной системой белкового синтеза. Угнетение этого процесса закономерно приво­дит к резкому снижению вирусной репродукции. Этот путь используется клеткой, например, в ходе развития антивирусного статуса при воздействии на клетки интерферона [46]. Однако селектив­ность такого воздействия невелика, и действие интерферонов затрагивает как вирусные, так и клеточные процессы. В клетке, находящейся в антивирусном статусе, в равной степени разру­шены и вирусные, и клеточные мРНК, благодаря чему подавлен синтез как вирусных, так и кле­точных белков.

C развитием методических подходов к из­учению внутри- и межклеточных механизмов передачи сигнала было выяснено, что многие вирусы способны использовать для собствен­ной репликации и другие метаболические и сиг­нальные клеточные сети [47]. В результате мно­гочисленных исследований были разработаны специфические ингибиторы каждого из них, а за последние несколько лет была обнаружена и охарактеризована их противогриппозная ак­тивность. Приведем наиболее изученные в этом отношении примеры.

При инфицировании клетки вирусом гриппа активируется центральный и наиболее изучен­ный путь регуляции врожденного противови­русного иммунитета — сигнальный путь NF-kB. В клетках он контролирует экспрессию генов, регулирующих острый воспалительный от­вет, адгезию и дифференцировку клеток, апоп­тоз и ответ на вирусную инфекцию. На ранних стадиях инфекция приводит к активации ком­плекса PI3K/Akt и последующей активации экс­прессии NF-kB. Он, в свою очередь, регулирует экспрессию многих генов, включая, в том числе, проапоптотические факторы TRAIL, Fas и FasL. Два последних активируют эффекторные белки апоптоза — каспазы, ферменты, осуществляю­щие специфическую деградацию комплекса ядерных пор в инфицированной клетке [12, 13, 51, 63]. Такая деградация является одним из пер­вых этапов многоступенчатого процесса про­граммируемой клеточной гибели. При помощи этого механизма ценой гибели инфицированной клетки достигается ограничение размножения вируса во всем организме.

Однако следует учитывать, что в ядре зара­женной клетки происходят процессы транскрип­ции и репликации вирусного генома, и присут­ствуют многочисленные фрагменты вирусных РНП, которым предстоит выйти через ядерные поры в цитоплазму для участия в сборке вирио- нов потомства. На последней стадии описанного каскада реакций — деградации ядерных пор бла­годаря активности каспаз — диффузия вирусных РНП через разрушенные поры существенно об­легчается по сравнению с порами интактными. Таким образом, являясь исходно противовирус­ным сигнальным путем, призванным ограничи­вать вирусную репродукцию, NF-kB в опреде­ленный момент, напротив, способствует более активной реализации жизненного цикла вируса [38]. Угнетение этого сигнального пути мешает реализации вирусной программы репликации и снижает эффективность продукции вирионов потомства.

Препараты-ингибиторы этого пути принад­лежат к различным химическим группам и воз­действуют на различные компоненты каскада [18]. Одни из них (SC75741) нарушают связыва­ние NF-kB с ДНК, препятствуя тем самым ин­дукции факторов апоптоза и активации кас- паз, другие (PS-341 (бортезомиб), MG132, VL-01 и др.) являются ингибиторами протеосом, пре­пятствуя убиквитин-зависимой деградации IkB или ингибируют NF-KB-активирующую киназу IKK (ацетилсалициловая кислота, LASAG), что в дальнейшем приводит к угнетению процесса фосфорилирования и деградации IkB. В целом, независимо от конкретной точки приложения, ингибирование тех или иных компонентов пути NF-kB приводит к снижению вирусной продук­ции в клетке [17].

Другим примером использования клеточ­ных путей вирусом гриппа является сигнальный путь Raf/MEK/ERK [33]. Как известно, транс­ляция вирусных белков происходит в цитоплаз­ме инфицированной клетки. Синтезированные поверхностные белки вириона — мембранный белок M1, гемагглютинин (HA) и нейраминида- за (NA) — транспортируются к плазматической мембране, встраиваются в нее и формируют кла­стеры. РНП потомства транспортируются к сай­там скоплений поверхностных белков, взаимо­действуют с белком М1 и цитоплазматическими доменами HA и NA, что приводит к искривле­нию мембраны и дальнейшему почкованию ви- рионов потомства [48].

Формирование вирусных РНП происходит в ядре инфицированной клетки. С одной сто­роны, для полноценного формирования им не­обходимо находиться в ядре достаточно долго, чтобы образовать полноценную сердцевину бу­дущих вирионов. С другой стороны, к моменту образования кластеров HA и NA на плазмати­ческой мембране им необходимо транспортиро­ваться к сайтам сборки и почкования вирионов, то есть должен существовать механизм, запус­кающий или подавляющий ядерный экспорт РНП в зависимости от стадии развития инфек­ционного процесса в клетке. Таким механизмом и является сигнальный путь Raf/MEK/ERK. Его активация индуцируется сборкой агломератов вирусных гликопротеидов на поверхности клет­ки, и его компоненты направляют транспорт РНП к плазматической мембране. На сегодняш­ний день неясно, каким именно образом это происходит. Однако ингибиторы этого сигналь­ного пути в значительной степени препятствуют нормальному протеканию вирусной инфекции и накоплению вируса в высоких титрах [35, 45].

Одним из первых этапов пути Raf/MEK/ ERK, является активация белка Raf при помо­щи ГТФ-связанной формы белка Ras. Посколь­ку примерно половина новообразований чело­века содержит в клетках мутации в генах raf или ras, разработка ингибиторов этих генов ве­лась исключительно в аспекте онкологических проблем. Так, шесть препаратов, доведенных до II фазы клинических исследований в обла­сти противораковой химиотерапии, оказались эффективными ингибиторами гриппозной ин­фекции. Это соединения, близкие между собой по химической структуре — U0126, препараты CI-1040 и PD-0325901, AZD-6244 и AZD-8330, а также препарат RDEA-119 (рис. 2). Их 50% ин­гибирующие концентрации в отношении виру­са гриппа лежат в пределах от 1200 до 4 нМ, что свидетельствует об их высокой противовирус­ной активности [11, 20].

Рисунок 2. Ингибиторы сигнального пути Raf/MEK/ERK, доведенные до стадии клинических исследований

Еще один сигнальный путь — PI3K/AKT/ mTOR — также используется вирусом гриппа для обеспечения собственной репликации [12]. В клетке этот путь регулирует дифференци- ровку, метаболизм и инициацию трансляции, а также во многом пересекается с другими сиг­нальными путями, такими как Raf/MEK/ERK и NF-kB. В ходе вирусной репродукции этот путь используется на ранних этапах вирусной инфекции — для регуляции проникновения вируса в клетку, а также на поздних стадиях — для правильной локализации вирусных РНП и предотвращения преждевременного апопто­за инфицированных клеток. Бактериальный метаболит вортманнин и морфолиновое производное кверцетина LY294002, хотя и не были доведены до стадии клинических исследова­ний из-за низкой биодоступности, явились, тем не менее, важным инструментом для фундамен­тальных исследований, связанных с передачей сигнала посредством PDK-пути, а также осно­вой для разработки оптимизированных произ­водных [34]. Одно из них, NVP-BEZ235 (рис. 3), проходит II фазу клинических исследований в качестве противоракового препарата [47].

Рисунок 3. Структура NVP-BEZ235 — ингибитора PI3K/AKT/mTOR [47]

Описан еще один сигнальный путь, связан­ный с гриппозной инфекцией. Инфицирова­ние вирусом гриппа активирует сигнальный белок C-Jun терминальную киназу (JNK). Она, в свою очередь, активирует фактор транскрип­ции AP-1, который стимулирует экспрессию интерферона-в, играющего важную роль в про­тивовирусном ответе клетки. Ингибирование JNK, следовательно, должно приводить к по­вышению вирусной продукции. Тем не менее, синтетические ингибиторы SP600125 и AS601245 (рис. 4), напротив, снижали уровень репродук­ции вирусов гриппа независимо от их подтипа. Противовирусная активность этих препаратов была обусловлена их способностью ингибиро­вать синтез вирусных РНК при помощи не вы­ясненного пока механизма [43]. Известно также, что SP600125 не влияет напрямую на активность вирусной РНК-полимеразы, а подавляет актив­ность вирусного белка NS1, что, по-видимому, приводит к большей эффективности системы противовирусного врожденного иммунитета. Эти результаты были подтверждены в опытах на животных, где SP600125 снижал вирусную нагрузку в легких мышей по сравнению с конт­рольной группой.

Рисунок 4. Структуры SP600125 (а) и AS601245 (б) [43]

В работе Kumar et al. [30] были идентифициро­ваны два ингибитора тирозинкиназных рецепто­ров, также проявляющих выраженную противо­гриппозную активность. Один из них, AG879, является селективным ингибитором сигналь­ного пути, обусловленного рецептором фактора роста нервов и рецептором эпидермального фак­тора роста 2 (TrkA/HER2), другой — тирфостин А9 — ингибирует сигнальный путь фактора роста тромбоцитов (PDGFR). Каждый из этих ингиби­торов угнетает по крайней мере три внутрикле­точных стадии жизненного цикла вируса — оба ингибируют синтез всех трех типов вирусспе­цифических РНК, блокируют ядерный экспорт вирусных РНП, а также предотвращают почко­вание дочерних вирусных частиц, воздействуя на путь, направляемый ферментом биосинтеза липидов — фарнезилдифосфатсинтетазой.

Говоря о роли клеточных киназ в цикле ре­пликации вируса гриппа, следует также упомя­нуть об исследовании Konig et al. [27], в котором при помощи полногеномного скрининга были идентифицированы 295 клеточных факторов, необходимых для репликации вируса. Большая часть этих белков является киназами, то есть ферментами, регулирующими большинство кле­точных сигнальных путей. В дальнейшем путем анализа стандартной библиотеки из 300 киназ [37] были изучены ингибиторы киназ широко­го спектра, в результате чего идентифицировано вещество ON108110, эффективно ингибирующее 25 из 300 проанализированных киназ. При этом 8 из них оказались ранее охарактеризованы как необходимые для репликации вируса.

Дальнейшее тестирование показало, что ON108110 угнетает ядерный экспорт вирус­ных рибонуклеопротеинов и/или репликацию вирусных РНК, частично воздействуя также на клеточные механизмы транскрипции. Одна­ко вирусный полимеразный комплекс оказался гораздо более чувствителен к воздействию пре­парата, что позволяет использовать его в до­зах, лежащих ниже порога токсичности. Кроме того, ON108110 снижал продукцию двух других РНК-геномных вирусов — вируса везикулярного
стоматита и вируса болезни Ньюкасла, что ука­зывает на его роль в ингибировании киназ, не­обходимых для репродукции не только вируса гриппа, но и других вирусов.

Одной их форм реакции клеток на стрессор- ные воздействия является аутофагия — высо­коконсервативный для всех эукариотических клеток процесс. Исходно аутофагия была иден­тифицирована как процесс, индуцированный голоданием клетки. Однако к настоящему време­ни известно, что он играет важную роль в физио­логии и патофизиологии и является клеточным ответом на самые разные стимулы, в том числе на вирусную инфекцию. Он также может играть роль в поддержании репродукции вируса гриппа в клетках. В условиях угнетения аутофагических процессов фармакологическими препаратами или при помощи РНК-интерференции выход вирусного потомства и синтез вирусных белков значительно снижаются. Аутофагия, таким об­разом, является одним из ключевых процессов, обеспечивающих репликацию вируса гриппа.

Zhou et al. [64] было показано, что гриппозная инфекция запускает в зараженных клетках обра­зование аутофагосом и стимулирует синтез бел­ка LC3-II — специфического маркера этих орга- нелл. Обработка таких клеток 3-метиладенином или вортманнином — ингибиторами аутофа- гии — снижала выход вирусных частиц в 2—5 раз, а инфекционность вирусного потомства — при­близительно на порядок. Сходные результаты были получены при инактивации гена LC3 при помощи специфических siRNA. Механизмы по­добных взаимоотношений вируса и клетки оста­ются до конца не выясненными.

Группой исследователей [7] была даже скон­струирована система скрининга противогрип­позных препаратов на основе анализа взаимо­действия между компонентами аутофагического пути. Способность химических соединений уг­нетать взаимодействие белков Atg5, Atg12 и Atg16 была трактована как потенциальная противо­гриппозная активность. На панели из 83 расти­тельных препаратов традиционной китайской медицины было идентифицировано соединение эводиамин (рис. 6) — алкалоид, содержащийся в экстракте эводии (Evodia rutecarpa Benth.) спо­собное ингибировать образование аутофагосом, индуцированное гриппозной инфекцией, а так­же обладающее противовирусной активностью в отношении широкой панели вирусов гриппа разных подтипов. При этом токсичность эво­диамина составила 100 мкг/мл, а показатель 50% эффективной дозы — 1,6 мкг/мл, что дает индекс селективности около 60 и свидетельствует о вы­соком противовирусном потенциале этого сое­динения и возможности дальнейшей оптимиза­ции его структуры для повышения активности.

Рисунок 5. Структура киназного ингибитора ON108110 [37]

Рисунок 6. Структура эводиамина — ингибитора аутофагии, обладающего противогриппозной активностью [7]

Таким образом, как видно из приведенных примеров, помимо воздействия непосредствен­но на вирусные мишени, размножение вируса гриппа может быть подавлено при помощи мо­дуляции клеточных сигнальных путей. Сле­дует отметить, что несмотря ни на доказанный противовирусный потенциал, ни на разрешен­ное клиническое применение, большинство из перечисленных соединений не используется в качестве средства для терапии гриппа. В пер­вую очередь, это связано с высокой комплексно­стью сигнальных путей-мишеней. Подавляющее большинство этих препаратов разработаны для использования в области онкологии, то есть спо­собны вмешиваться в работу важных для клетки и организма сигнальных систем, регулирующих такие принципиальные процессы, как апоптоз, деление и дифференцировка, ангиогенез и т.д. Воздействие на них, помимо ограничения про­дукции вируса, приводит ко многим побочным эффектам, которые могут существенно сдвигать соотношение «выгода/риск» в сторону риска для здоровья. Кроме того, особенности фармаколо­гического рынка диктуют необходимость разде­ления препаратов для лечения опухолей и респи­раторных вирусных инфекций. Иными словами, в практике фармакологии стремятся избегать одним и тем же действующим веществом лечить и онкологические заболевания, и грипп. Эти аспекты в некоторой степени ограничивают раз­работку эффективных противогриппозных пре­паратов, направленных на клеточные мишени.

Некоторые соединения, как было уже упомя­нуто, сочетают в себе несколько типов активно­сти, каждая из которых приводит к снижению вирусной нагрузки, уменьшению интенсив­ности воспалительных процессов, нормализа­ции структуры ткани при тяжелой гриппозной инфекции, и т.п. Так, например, глицирризи- новая кислота (ГК) является эффективным и малотоксичным индуктором IFNy В работе Utsunomiya et al. [57] было показано, что благо­даря этой способности глицирризиновая кис­лота на 100% предотвращает смертность мышей от гриппозной инфекции при заражении дозой вируса A(H2N2) 10 LD₅₀. Параллельная обра­ботка животных антителами к IFNy полностью снимала протективный эффект ГК, что доказы­вает механизм ее защитного действия. С другой стороны [40], показано, что ГК является мощ­ным имуномодулятором. В терапевтических дозах на модели гриппозной инфекции макро­фагов человека, вызванной высокопатогенным вирусом гриппа H5N1, ГК снижала продукцию провоспалительных цитокинов CXCL10, IL-6 и CCL-5, а также ингибировала вирусиндуци- рованный апоптоз. При этом не было отмечено никакого влияния этого соединения на продук­цию вируса в клетках.

Кроме того показано [41], что в клетках A549, являющихся аналогом альвеолоцитов челове­ка, ГК ингибировала репликацию высокопато­генного вируса гриппа H5N1, снижала степень вирусиндуцированного апоптоза клеток и экс­прессию провоспалительных цитокинов. Не­ясно, является ли такая активность следствием или независима от собственно ее противови­русной активности. Известно, что оболочечные вирусы в процессе слияния вирусной и кле­точной мембран нуждаются в определенной текучести липидного бислоя и следовательно, зависят от реологических свойств клеточной мембраны. Так, снижение текучести мембра­ны на 5% ингибировало размножение ВИЧ-1 на 56%, а 5%-ное повышение текучести напро­тив, повышало инфекционность вируса в 2,4 раза [21]. Показано также, что те же закономер­ности применимы и в случае гриппозной ин­фекции [61]. В высоких концентрациях ГК пре­пятствует интернализации вирионов гриппа, взаимодействуя с мембранами и снижая их те­кучесть. Эти свойства объясняют также актив­ность ГК in vitro в отношении других вирусов — SARS-ассоциированного коронавируса, ВИЧ-1, респираторно-синцитиального вируса, вируса гепатита В, арбовирусов, вируса осповакци­ны, вирусов группы герпеса (вирус варицелла- зостер, вирус простого герпеса 1 типа, вирус Эпштейна—Барр, цитомегаловирус, вирус сар­комы Капоши) и вируса везикулярного стома­тита [15]. В дополнение к уже описанным ме­ханизмам подавления вирусной репродукции, известно, что ГК снижает мембранный транс­порт и сиалирование поверхностного антигена вируса гепатита В, а также ингибирует фермен­ты фосфорилирования при инфекции, вызван­ной вирусом везикулярного стоматита [15].

Таким образом, несмотря на противоречивые сведения о наличии у ГК прямой противови­русной активности в отношении вируса гриппа, можно говорить, что она является, тем не менее, потенциально важным компонентом комплекс­ной противогриппозной терапии благодаря на­личию других типов биологической активности, важных при лечении тяжелой и осложненной инфекции. В наших собственных исследова­ниях [1, 2] продемонстрирована протективная активность ГК против вирусов гриппа A(H1N1) pdm09 и A(H3N2). Снижение титра вируса в тка­ни легких при этом составило приблизительно 1 порядок. При этом достоверного противови­русного действия в культуре клеток MDCK от­мечено не было. Добавление к ГК иммуномоду­лирующего дипептида а-глутамилтриптофана повышало противовирусную активность ком­бинации, снижая вирусный титр на 5—6 по­рядков по сравнению с контролем и гибель жи­вотных — на 77%. Таким образом, комбинация двух препаратов, неактивных in vitro, имела вы­раженный эффект in vivo, и механизмы этой ак­тивности следует расшифровывать в дальней­ших исследованиях.

Преимущества описанного подхода к терапии гриппа очевидны. В отличие от этиотропных соединений, против которых вирус способен вырабатывать устойчивость, препараты против клеточных мишеней лишены этого недостат­ка. По сравнению с вирусом гриппа, клетка — гораздо более сложная система, обладающая многими уровнями контроля за возникнове­нием мутаций и их коррекции, вплоть до гибе­ли клетки, несущей эти изменения. Во-вторых, в дополнение к антивирусной активности, мно­гие препараты этой группы обладают други­ми видами биологической активности — про­тивовоспалительной, цитопротекторной и др. Такая активность не столь важна в случаях за­болеваний средней тяжести, однако становит­ся жизненно важной, когда речь идет о случаях позднего, тяжелого и осложненного гриппа, где ведущую роль в патогенезе играют не вирусные, а реактивные процессы. Список препаратов — потенциальных кандидатов для комплексной терапии гриппа, разумеется, не исчерпывается соединениями, перечисленными в настоящем обзоре. С развитием представлений о патогенезе гриппозной инфекции как о сложном процессе, включающем связанные и взаимозависимые ка­скады реакций, появляются основания включать все больше число ингибиторов каждого из них в число лекарств, способных нормализовать течение гриппа. Сюда относятся статины, ин­гибиторы ангиотензин-конвертирующего фер­мента и блокаторы ангиотензинового рецептора, агонисты рецепторов, активируемых перокси- сомными пролифераторами и агонисты АМФ- активируемых протеинкиназ, и др. [14].

В настоящем обзоре мы ограничились те­рапией одной только гриппозной инфекции. Описанные соединения, однако, воздействуют на процессы, общие для тяжелых воспалитель­ных заболеваний, независимо от конкретной этиологии — продукцию провоспалительных цитокинов, миграцию клеток в очаг воспаления, и т.п. Поэтому следует ожидать, что соединения, активные при гриппе, окажутся также эффек­тивными и при других вирусных заболеваниях сходного патогенеза, как это имеет место в слу­чае ГК. Следовательно, дальнейшие исследова­ния в области поиска и оптимизации ингибито­ров клеточных компонентов как средств против гриппозной инфекции могут привести к разра­ботке новых противовирусных препаратов высо­кой эффективности, широкого спектра действия и низкой вероятности развития резистентности.

Таким образом, препараты для терапии грип­позной инфекции следует разделять как по меха­низмам действия, так и по срокам применения. Во-первых, это препараты, наиболее эффектив­ные для профилактики и экстренной профилак­тики (интерфероны и их индукторы). Во-вторых, это препараты этиотропного механизма, ис­пользование которых необходимо на всех сроках гриппа после постановки диагноза, но эффек­тивно лишь на ранних стадиях заболевания. На­конец, в-третьих, на дальних стадиях и в случаях тяжелой и осложненной инфекции необходимо использование соединений патогенетического механизма действия, которые могут снижать или не снижать собственно вирусную репродукцию. При этом применение препаратов, действующих на систему врожденного иммунитета, является абсолютно целесообразным как в раннем перио­де терапии, так и в более поздние сроки, при этом сочетанное применение специфических и не­специфических препаратов представляет собой оптимальный путь повышения эффективности терапии гриппа.

Дополнительная информация о МБНПК Цитомед: клинические исследования препаратов.

Источник